生产 | 高通量微型生物反应器及其在生物制药中的应用

随着生物制药行业的快速发展及竞争加剧，缩短药品开发周期，开发高效、稳健和高质量的生产工艺并降低生产成本显得尤为迫切。目前大部分企业使用高通量技术、平台工艺以及一次性生产技术等来加速产品开发。其中高通量技术可同时开展多组实验进行实验设计(DOE)，可缩短工艺开发时间且能够得到较好的实验效果。高通量微型反应器的种类繁多，早期的产品如微孔板、24深孔板，其体积量在微升级别，多用于原始克隆筛选，但是因无法对细胞培养过程中重要参数监控，导致使用范围受限，并逐渐被淘汰。目前应用广泛的3种高通量微型生物反应器分别是 Simcell、Ambr 15、Ambr 250，其培养体积规模各不相同，适用于不同的细胞培养工艺开发阶段。

SimCell微型反应器系统包括5个培养室，每个培养室含有42个卡式微型反应器模块，每个模块有6个总体积<800μL独立控制的微型反应器(培养体积为300-700 μL) ，一台SimCell系统理论上最多可同时运行1260个微型反应器。每个培养室可独立控制温度、相对湿度及通气量，可在线测量细胞密度、pH及溶氧（DO）等参数。SimCell微型反应器可用于克隆筛选及早期工艺优化。SimCell系统的显著优势为超高通量和超微体积，但小体积无法满足常规离线分析需求，且无搅拌桨，不能很好地拟合大规模反应器。

Ambr 系统由一次性反应器罐体、自动化工作站及操作软件3部分组成，包括Ambr 15 和 Ambr 250。Ambr 系统具有高通量、自动化及体积小等优势，且罐体几何学设计如高径比、桨叶设计等均与经典搅拌反应器类似，可实时监测和控制工艺过程中的各个参数，具有良好的平行性与放大性。Ambr 系统软件具备较高效的数据记录、管理和分析能力，可以在工艺开发和晚期临床阶段执行 DOE 和数据分析。目前 Ambr 系统在生物制药行业中得到了较为广泛的应用。Ambr 15工作体积为10～15mL，一次可运行24～48个生物反应器，具有搅拌桨和独立通气管路。除温度和转速由工作站统一控制外，其他参数如pH 及 DO 均可独立控制。基于高度自动化的机械臂，Ambr 15 系统可自动完成取样及补液操作。由于Ambr 15 系统培养体积较小，限制了培养过程中的取样频率和收获体积，无法为下游纯化及制剂分析提供足够多的样品。此外，细胞培养过程中取样、补料及补碱等操作可能会引起Ambr 15系统在线 DO、pH及温度的波动。

Ambr250是Ambr 15 的升级产品，能独立运行12～24个一次性生物反应器，工作体积为100-250mL，可满足后续纯化和样品分析需求，可独立控制温度和转速，有4条补料管路连接每个反应器，可实现分批补料(10μL～10mL) 或连续流加，实现细胞培养和微生物发酵不同工艺的需求。Ambr 250一次性反应器含有双层斜三叶桨，嵌合4个挡板以促进液体混合，与传统生物反应器有类似的几何尺寸及流体力学性质，从而保证 Ambr 250细胞培养的微环境在一定程度上与传统反应器更接近，工艺容易放大。

近年来，高通量微型生物反应器已在生物制药行业得到广泛应用，可应用于细胞株筛选、培养基与工艺开发及工艺表征等各个阶段。

细胞株筛选要先把目的基因整合到基因组中，而这个过程是随机的，因此，转染后的每个细胞表现各异，需进行大量克隆筛选以得到最终的高产稳定细胞株。一般使用微孔板等进行早期高通量克隆筛选，然后在24深孔板、摇管或摇瓶中补料分批培养进行进一步筛选。从24深孔板、摇管或摇瓶中筛选得到的表现较好的细胞株在放大至反应器时会出现不一致情况，这是由于部分高表达克隆不具备可放大性，另外这些培养容器不能监控pH 与 DO 等关键参数，培养微环境与台式反应器相差甚远，不能很好地预测高产克隆在反应器规模上的表现。传统反应器由于通量低且运行成本高，评估的克隆数量有限，也不是理想的克隆筛选工具。为降低细胞株在工艺放大时出现异常风险，可使用高通量 Ambr 系统进行筛选评估，其具有较好的预测性和可放大性，是高效可靠的克隆筛选工具。此外，可通过整合的克隆筛选软件进行克隆筛选排序评分，为候选克隆的选择提供指导。此外，培养基开发是提高产量、质量及降低生产成本的关键手段之一。高通量细胞培养设备可用于培养基的高通量快速筛选，优化培养基的关键组分。

使用Ambr 15 反应器同步运行24个实验条件考察接种密度、pH及 DO 等3个关键工艺参数，结果显示相同条件下的反应器在细胞生长、代谢以及蛋白表达方面表现具有高度一致性，不同条件下的反应器则有明显区别，大大提高了工艺优化的效率。分别在摇瓶和Ambr 15 反应器中测试一种新开发的培养基，结果发现Ambr 15 反应器中的细胞活率和蛋白产量相比于摇瓶均有明显下降。经过分析，Ambr 15反应器中蛋白产量和细胞活率的下降可能是由于乳酸浓度增加引起的。为了研究Ambr 15 反应器中乳酸浓度升高的原因，考察了转速、通气和pH 对乳酸积累的影响。结果显示，通气和pH 控制策略对乳酸积累有统计学意义上的影响，其中pH 影响显著。使用优化后的条件在Ambr 15 中运行，达到了与摇瓶培养一致的细胞活率和表达水平。高通量微型生物反应器中进行的工艺优化需放大至生产规模反应器中，因此评价设备和工艺的可放大性也尤为重要。研究发现，将在Ambr 15 中开发的细胞培养工艺分别放大至2L反应器和80L，400L Zeta 不锈钢生物反应器，结果显示 Ambr15 与不同规模的反应器在细胞生长、代谢、蛋白表达及产品质量属性上均比较一致。这一结果显示Ambr 15 反应器具备较好的可放大性。

细胞培养工艺表征的目的是研究关键操作参数与细胞培养关键性能指标如细胞生长、产品表达及最终产品关键质量属性等之间的关系，来确定各关键操作参数的可接受范围，并证明工艺的稳健性。传统上，一般使用1~10L规模的台式反应器进行大量的 DOE 实验以评估各个参数的主效应及交互作用影响，这需要投入大量的时间、人力和资源。高通量 Ambr 系统作为缩小模型进行工艺开发和工艺表征已有不少研究。

Ambr 系统可作为高效的缩小模型应用于工艺开发与工艺表征，能显著加快工艺开发和工艺表征过程。不过 Ambr 系统作为商业化生产工艺的缩小模型来进行工艺表征仍面临一些挑战。首先，缩小模型标准在 Ambr 和大规模生物反应器间是不可比的，需要对 Ambr 系统进行更详细更有针对性的表征研究，并采用新的缩小模型策略。其次，需要采用更合适的风险评估及统计分析软件来解决高通量实验设计及数据分析的瓶颈。最后，需要认识到并非所有的工艺都可利用 Ambr 系统建立缩小模型，要充分了解设备的限制以及相关的关键操作参数及关键质量属性。

高通量微型生物反应器系统在早期工艺开发阶段可使用 DOE 实验进行高通量工艺研究，缩短工艺开发时间并降低人力物力成本，加速晚期临床阶段工艺优化与工艺表征，推进生物药物的快速发展。高通量微型反应器具有操作简单、通量高、成本缩减等优势，能够较大程度提升工艺开发的效率，降低研发成本和缩短研发周期。同时，这类反应器可有效结合DOE 设计进行工艺开发，提高工艺稳定性和工艺质量可控性，这也使得高通量微型反应器的应用前景更为广阔。

参考文献：       

[1]姚小员,裴新,查鑫华,张磊,季宇.高通量微型生物反应器在生物制药行业中的应用[J].中国新药杂志,2021,30(22):2075-2082.       

[2]郭玉蕾,唐亮,孙瑞强,李尤,陈依军.高通量微型生物反应器的研究进展[J].中国生物工程杂志,2018,38(08):69-75.DOI:10.13523/j.cb.20180809.

作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。

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