微生物发酵浅谈（三）：发酵罐如何开始小试发酵

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微生物发酵项目放大需经过小试、中试到大生产的过程。其中摇瓶前规模为小试，以发酵罐到更大规模发酵罐为中试。中试放大一是可以探索实验室的新菌种的生产效能，探索之前确定的发酵环境的适配性与在优化，包括发酵培养基配方和工艺条件；中试放大二是可以对生产上发现的问题进行小规模再研究，可降低纠错成本，中试放大是小试实验研究到工业化生产的过渡，也是微生物发酵项目成功的必需，而其中上发酵罐又是这过程的关键一步，因为从摇瓶到发酵不仅仅是量的变化，更是增加反馈与控制的第一次质变。

曾经有人包括合成生物学的博士咨询笔者，小试发酵如何设置发酵罐并开始发酵呢？个人回答一般的方法论是，参照摇瓶或者一般知识确定起始参数开启发酵，再结合罐上的具体情况科学调整逐步优化。

第一步，通过说明书或者与厂家工程师交流熟悉发酵罐。国内的品牌有国强、百仑、保兴等的，其硬件与软件都不一样，仅仅是使用的话熟悉起来也很容易。按照搅拌系统、温控系统、补料系统与供排气系统等几个系统去了解，pH、溶解氧等电极按照说明书标定，补料的泵速按照说明书用天平与水来标定。需要注意的是，小型发酵罐启用前可能是直接放入灭菌锅里灭菌的，所以灭菌时需要断开一切的反馈与控制的连接，而在灭菌完成后开始发酵前又要及时与控制柜做好各系统的连接。

第二步，通过摇瓶或者一般知识确定起始参数。

① 我们把发酵罐的基础料体积除以发酵罐的总体积的得数叫装料系数，这个系数因搅拌大小、泡沫大小及罐本身的设计与大小而有所不同，一般地刚开始上罐时可以定在40-60%，比如5L的罐基础料可以是2L到3L；

② 先可以直接采用摇瓶发酵时的培养基配方，或者通用的网络可查的各类菌对应的通用配方。按照罐的控制系统补料泵个数，考虑几路控制补料。消泡剂控制发酵过程中可能的起泡，这个的反馈与控制可利用罐上的泡沫感应器自动控制；酵母控制pH可采用液碱，大肠杆菌控制pH可采用氨水，这个的反馈与控制可利用罐上的pH计自动控制；补充氮源来生产蛋白或者补充碳源来生产其他产物，这个也可自动控制，只是因牵涉到整个工艺调整，后续再展开；

③ 我们把多少通风量L/min除以料液体积L的得数叫vvm，这个系数因菌种对氧的需要及罐本身的设计而有所不同，小罐试验时可初定比较高一点的，比如酵母1，大肠杆菌1.5，再按照基础料体积计算后先不变动；

④ 搅拌转速，一般建议根据摇瓶而来起始设定为200rpm，随着菌体的生长，之后设定溶解氧在30%左右时关联搅拌提速，也可手动逐步提速。酵母8h前延滞期内，大肠杆菌4h前的延滞期内溶氧下降缓慢而搅拌转速可不提升，经过对数生长期时是搅拌逐步提升的过程，酵母16h左右到400rpm，大肠杆菌8h左右到600rpm。

第三步，结合罐上的具体情况科学调整逐步优化。即使前几批主要是与设备磨合的一些调整，其实发酵已经开始，而你也开始涉及到发酵工艺调整了。

① 如果延滞期过长，或者平台期的OD600较低。可从提升接种量、优化培养基碳氮比，增加微量元素等措施试试改善。

② 如果补料过多，或者发酵罐体积过大。可从下调基础料体积，降低补料速度或者提升补料浓度等措施试试改善。

因为发酵罐补料使营养比摇瓶丰富，高转速下传质传热比摇瓶好，其控制的维度也比摇瓶多，量变到质变，故此认为与摇瓶相比发酵罐是一次质的飞跃，发酵罐有比摇瓶复杂得多的内容。

真正要做到持续稳定发酵，需要有微生物知识与无菌操作作为前提，有对物料、设备、自动化控制的理解及一定的检测分析能力作为解决异常的保障，还要有系统化的分析思维，因为在发酵过程中各参数是相关关联的，一个结果对应的原因是多方面的，有时甚至是反向的，比如pH突然上升是罐压下降或者碱液泵自控异常、发酵液染菌异常还是缺糖；比如泡沫异常时，是补料不够缺营养，还是补料过多生长过快导致自溶等等，需要经过多手段确认后再去调控方可保证发酵持续稳定，这些在后续再展开。今天你已经开始使用发酵罐了。

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