多肽 | 影响多肽自组装的因素及其修饰方法

自组装多肽是指在一定条件下，能通过π-π 堆积、静电相互作用等分子间作用力，形成组装体的多肽类材料。自组装多肽具有良好的生物相容性和可控性，能够形成颗粒、纤维和凝胶等纳米结构，发挥特定的形貌学功能，广泛应用于生物医学等领域。由于多肽的组装特性及其自身的生物功能，以及为了满足药物递送、疾病诊疗等需求，需要在多肽上进行修饰，修饰后的组装肽在组装能力和生物医学应用方面更具有优势。

自组装多肽的类型

RADA16-I是经典的离子互补性多肽，其在水溶液中能自发地形成纤维水凝胶，已应用于生物医学和临床领域。离子互补性多肽由带负电的氨基酸残基和带正电的氨基酸残基交替排列，通过静电相互作用、氢键、范德华力来启动分子自组装。其亲水区和疏水区交替排列，分成两个有序的区域，疏水氨基酸残基折叠屏蔽水分子，亲水区具有规则有序的正负电荷相互吸引。分子间氢键的形成加速了肽的自组装，离子键的相互嵌合使自组装结构强度增加，不过，此类肽最大的缺点是在低 pH 时，稳定性较差。为了弥补离子互补性多肽的缺点，人们开始致力于改变疏水作用力进一步研究亲水氨基酸和疏水氨基酸的比例关系，表面活性剂类多肽 (Surfactant-like peptides，SLP) 就此产生。SLP 通过模拟多肽聚合与表面活性剂分子的性质，分为疏水区和亲水区，亲水头部一般由1–2 个带电的氨基酸残基 (His、Asp、Glu) 组成，疏水尾部一般由 3–9个非极性氨基酸(Ala、Phe、Ile、Val) 组成。SLP可组装成纳米管、纳米囊、纳米纤维结构。近年来，科学家们已经不满足于通过对天然氨基酸的改变来设计自组装多肽，而是使用高度疏水的烷基链、脂质基团以及糖类等修饰多肽。化学基团修饰多肽表现出二级结构增多从而使纳米体更加稳定。化学基团可以通过在肽链本身设计相应的功能区域发挥特定的作用。目前，关于疏水烷基链两亲性多肽自组装的工作被广泛报道。疏水作用力作为驱动分子自组装的核心力，通过在氨基端设计连接烷基碳链，可以使此类肽的功能和性质发生改变。

影响多肽自组装的因素

多肽自组装是一个动态平衡过程，氢键、疏水力、静电引力等对小分子组装成有序的纳米结构起着至关重要的作用。同样地，环境因素的改变也会引起自组装体形态和性质上的变化。

①pH值。二肽和多肽的自组装的重要核心驱动力是分子之间形成氢键。但氢键的形成易受pH 的影响，改变溶液的pH会使肽链的C端和N端或一些化学基团出现正电化或负电化。这就意味着肽链形成带正负电荷的多肽，从而表现出不同的自组装趋势、纳米结构和结构功能特点。pH值对于富含带电的氨基酸肽序列(如Glu、Asp、Lys、His和Arg)至关重要，并对氢键的形成与多肽首尾基团的呈电化具有显著影响，因此通过控制pH可以合理地设计基于不同酸碱度的其有释放药物、缓释等应用的自组装多肽。

 ②肽浓度。浓度是寡肽的自组装聚合的重要参数，浓度研究可以确定寡肽开始聚集的临界聚集浓度(Critical aggrcgation concentration，CAC)。寡肽在CAC下以单体分子形式存在，高于CAC时开始聚集。肽浓度高手临界胶束浓度(Critical micelle concentratioa，CMC)时，肽分子之间才发生缔结作用。浓度的改变会导致氢键等非共价键力的含量发生改变，这也会引起肽分子之间电子云重排，进而引起纳米形貌的改变，此外，致密的纤维网络表面可能与水等溶剂发生协同作用从而使纳米结构更加稳定。

③离子浓度。离子浓度是影响肽分子堆积和蛋白质性质结构功能的重要因素，盐离子的存在会使带电荷的基团产生屏蔽作用，从而使分子之间的静电作用减弱。电荷屏蔽作用还会引起分子间疏水键作用力的增强，使肽分子更容易聚合引起自组装。离子还会与个别氨基酸序列特异性识别并作用，在极性氨基酸中构成盐桥，从而通过分子间的物理交联促进自组装结构生成。由于多种离子在体内具有调控细胞新陈代谢、维持血管内外离子平衡以及促进骨质发育等作用，基于离子浓度响应的自组装多肽在医学领域具有广泛的应用潜能。

④温度。温度的升高会破坏体系的氢键，使自组装体系的稳定性减弱，从而发生构象上的改变。从头设计的肽分子 (KIGAKI)3-NH2 与一个中心四肽Thr-DPro-Pro-Gly 相连接，由于Pro 的存在，该肽偶联物分子在 20–50 ℃水溶液中表现为无规卷曲的形式，而将体系温度升高到60 ℃时，该偶联物初步显示为 β-折叠，继续升高温度至70 ℃，β-折叠结构显著增加并形成纳米纤维进而形成刚性水凝胶，温度的升高提高了疏水基团的溶解度，影响了亲疏水基团的平衡，这种行为可根据温度的变化发生可逆性转变。升高温度后，多肽自身的氢键发生断裂，二级结构发生改变，疏水作用力和π-π 堆积成为主要推动分子自组装的作用力，从而导致纳米结构的转变。当温度降低时，氢键重新生成，二级结构恢复，自组装多肽的纳米形态随之恢复。

⑤手性。自然界中的天然氨基酸都是 L 型的，而其对应异构体被设计出来显现出更好的优点和特性。手性氨基酸在控制多肽或蛋白质的折叠与超分子组装中起着关键作用。研究表明肽的手性不同会导致分子在溶液中的自组装趋向和分子结构的差异。用D-异构体取代 L 型氨基酸会导致形成组装体的重要参数(两亲性)的变化。

自组装多肽的修饰

自组装多肽的功能化修饰位点主要包括主链氨基和羧基，以及侧链的氨基、羧基、羟基和巯基等。修饰方式主要分为两种：一是直接修饰，即功能分子与多肽直接共价偶联，或是将活性基团活化以后将分子直接与多肽共价偶联。二是间接修饰，即利用连接单元将功能分子与多肽连接，一些分子有较大的空间位阻，或者由于自身没有可以高效与多肽进行连接的活性基团，需要引入其它分子作为连接单元。

 1、直接修饰       

直接修饰方法中的功能分子主要包括以下几类：

(1)药物分子修饰。将药物分子直接修饰在多肽上，实现药物的精准递送和疾病的治疗。利用小分子药物对病灶区域的识别、治疗和其自身的亲疏水等特性，将其与自组装多肽材料共价偶连，能够延长药物滞留，增强药效，降低毒副作用。为了更方便地将药物分子连在多肽上，需要将药物分子的某些官能团进行活化。如苯丁酸氮芥(CRB)又称瘤可宁，是一种常用的抗癌药物。CRB具有的正苯丁酸基，能够通过标准固相合成法(SPPS)共价连接到多肽的N端，即使用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)作为偶联剂，将CRB的羧基活化后，与多肽游离的氨基端反应生成酰胺键。有学者设计了一种新的自组装短肽CRB-YpYY，将 CRB 作为递送药物和封端基团，通过酰胺缩合共价结合到磷酸化短肽 YpYY的氨基端，替代常用的萘和芴类封端基团。CRB-YpYY 被肿瘤区域过表达的碱性磷酸酶剪切，变为CRB-YYY，原位自组装形成凝胶。相比游离的CRB 分子，这种凝胶展现出更好的肿瘤抑制效果。

 (2)探针分子修饰。利用自组装多肽的AIR 效应，实现探针在病灶部位的高效富集，增强成像的信噪比。小分子探针存在容易代谢，信噪比较差等问题。探针分子修饰的自组装多肽材料，能够利用活体自组装(in vivo assembly)策略，通过病灶部位的微环境促使多肽探针分子形成纳米组装体。多肽组装的AIR 效应可以减缓病灶区域探针分子的代谢，延长滞留时间，从而增强探针信号和信噪比。

 (3)烷基链修饰。利用烷基链调节亲疏水平衡，增强组装能力。脂肪链是结构简单的疏水性单元，可以用于调控自组装多肽的亲疏水平衡，修饰后的多肽能形成更加可控的组装体。脂肪链修饰非常简单方便，通常使用固相合成就能很方便地将脂肪酸偶联到多肽上。同时，对多肽进行类脂质修饰，能够增强组装体成颗粒能力，用于药物递送。

(4)聚合物修饰。聚合物位阻大，阻碍多肽组装，但在特定的策略中可以利用聚合物的特性。聚乙二醇(PEG)是一种低毒、低免疫源性的化合物，是两亲性组装分子的常用修饰单元，能够增强被修饰分子亲水端亲水能力，减少材料递送损失，延长分子在体内循环时间，PEG-NHS能够方便地通过固相合成偶联到多肽上，得到 PEG 化多肽。

(5) 糖基修饰。糖在生物体内参与多种生理活动，糖肽自组装体能够通过多价配位效应、酶剪切等方式参与生理活动。，例如甘露糖可以靶向巨噬细胞，同时糖上的羟基大大提高了整个分子的亲水性。所以通过化学修饰，将糖基偶联到多肽上可以进行多种应用。

(6)其他分子修饰。除了上述分子，其他小分子单元的引入也会对自组装多肽产生很大影响。如碱性磷酸酶(ALP)具有脱磷酸作用，在多种癌细胞表面过表达，被广泛用于控制两亲性肽的自组装。磷酸分子基团体积小，但有极强的亲水性，多肽中引入磷酸基团会导致分子整体亲水性增加。含萘单元(Nap)可以作为多肽的封端基团，利用萘的 π-π 相互作用提升短肽的自组装和成胶能力。2-萘乙酸能够直接通过固相合成方便地偶联到多肽上。

2、多肽间接修饰

为了实现某些生物功能或设计分子，需要在多肽上连接不同种类的功能分子。但由于有些功能分子空间位阻较大，或者功能分子单元自身没有能与多肽反应的官能团等因素，需要引入其他分子单元，一端与多肽连接，另一端与功能分子单元连接来达到目的。多肽间接修饰的方法众多，包括炔基和叠氮基团修饰、酸酐修饰和聚乙二醇修饰。叠氮-炔基基团之间的Husigen环加成反应可以用于多肽的修饰。一些分子上存在羟基、氨基等能与羧基反应的基团时，可以选择使用环状酸酐作为连接单元对多肽进行修饰。在一定条件下，羟基进攻酸酐的羰基碳，发生开环的亲核取代反应生成酯基，另一端的羧基暴露出来，可以通过固相合成与多肽进行连接。聚乙二醇(PEG)是一种亲水性的聚合物，有着良好的生物相容性，因此经常被用于生物材料。短PEG链可以作为连接单元将功能分子与多肽进行连接。

相关阅读：《多肽自组装机制及其在生物医药领域的应用》

参考资料       

[1]任涵,李茹祥,陈志坚等.自组装多肽的修饰方法及其应用[J].有机化学,2021,41(10):3983-3994.     

[2]于伟康,张珊珊,杨占一等.超分子多肽自组装在生物医学中的应用[J].生物工程学报,2021,37(07):2240-2255.

作者简介：小泥沙，食品科技工作者，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品及功能性食品的开发与研究。