DFTC2023发酵工艺分享大会咨询

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王煜：18829263008

01                    

 溶液1配方 50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8.0

02                    

 溶液II配方：0.2M NaOH，1%SDS

5）这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。  

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03                    

 溶液III配方：3M醋酸钾，2M醋酸 

1） 溶液III溶液III加入后就会有大量的沉淀，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

2）溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

3）而SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。

4）因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

5）2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。

6）基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。

7）所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

8）溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

9） 25/24/1的酚/氯仿/异戊醇PDS沉淀的形成并不能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

10）用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇的原因：酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

21)  非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。