DFTC2023发酵工艺分享大会咨询

微言：15829889297

王煜：18829263008

① 上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。

② 去除大肠杆菌自身表达的蛋白（两条 30KD-40KD），可用非变性缓冲液超声悬浮（可加入去垢剂），离心 6000r/min，30min，4~10℃。

③ 大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，摸索出其中纯度最佳的浓度。

① 如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂(如PMSF)改进。

② 可提高结合缓冲液中的咪唑浓度，以降低镍柱对杂蛋白非特异性结合。

③ 杂蛋白与目的蛋白发生了结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

④ 适当减少填料的使用量，因为加入过量的填料更容易对杂质产生非特异性吸附，造成纯度的降低。

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① 柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其它杂质颗粒所致，所以样品上样前要经过高速离心和过滤处理。

② 在纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，可尝试加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行)，如果不能解决絮状物的产生，可以适当添加尿素(如添加终浓度为2M的尿素)阻止蛋白的凝聚。

镍柱使用中出现棕色，主要是由于缓冲液中含有还原剂，如DTT，β-巯基乙醇，TCEP等，DTT等还原剂会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下镍离子会被DTT等还原剂还原生成棕色的沉淀，所以镍柱的生产商都强调要尽量避免在样品中添加高浓度的DTT（一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT）。

① 出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者蛋白本身性质就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境温度是否合适，或在缓冲液中加入低浓度的还原剂如DTT。

① 超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) ；

※ 应对方法：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。

②样品的结合缓冲液选择不正确 ；

※ 应对方法：检测缓冲液的 pH 及样品和结合缓冲液的组成分（是否误加了EDTA，EGTA等螯合剂）。

③ 组氨酸的标签没有完全的暴露 ；

※ 应对方法：在变性条件下(如添加8M 尿素，6M 盐酸胍，1%SDS)，此外加入 1-2mMDTT 进行纯化。

④ His 标签丢失；

※ 应对方法 1：WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要时增加 his 个数(常用 6-10 个)；

※ 应对方法 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；

※ 应对方法 3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子，如Cu2+，Zn2+，Co2+等。

Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。 

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① 洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）

※ 应对方法：增加洗脱液中咪唑的浓度

② 采用降低PH的方法洗脱，但应注意当PH低于 3.5,会导致镍离子脱落，因此使用此方法时不应将PH值降的过低

③ 蛋白在层析柱发生了沉淀

※ 应对方法：减少上样量和孵育的时间，添加去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度，或者在变性条件下进行洗脱(如用 8M尿素，或 6M 盐酸胍)，也可尝试在洗脱Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

④ 非特异性疏水结合或其他相互作用