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酵母表达系统是真核表达蛋白的常用系统之一，具有真核表达系统的许多优点：如生产成本低、发酵周期短、易于培养、操作简单方便、可大规模生产、基因遗传稳定等；它还有哺乳动物细胞表达系统的诸多优势，如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。因此，毕赤酵母受到越来越多研究机构和医药生产企业的青睐。特别是与CHO细胞相比，毕赤酵母有诸多优势，首先毕赤酵母与CHO细胞都是真核细胞，拥有高等真核表达系统的诸多优点；其次，毕赤酵母构建细胞株更快，不需要耗时的病毒清除验证步骤，极大缩短了研发周期；最后，从生产方面而言，毕赤酵母有更快、更容易、更便宜、更高产量的特点，还可以高密度、大规模培养，大幅降低抗体药物的生产成本。（下文所提到的酵母蛋白表达均为巴斯德毕赤酵母）

酵母蛋白表达与大肠杆菌表达有部分不同，大肠杆菌表达只需将质粒/载体转入到宿主菌体内，其载体携带复制起始点随着宿主染色体的复制而复制，可以稳定存在。而酵母表达相对复杂，设计的质粒/载体均不带有酵母自身复制起始点，因此如果直接导入到宿主菌中，不能稳定存在。所以必须将质粒/载体线性化，以同源重组的方式与宿主菌的染色体进行整合，这样外源基因才能够稳定存在，而且同源重组一旦形成会很稳定，在通过后期的筛选排除没有整合成功的质粒/载体和宿主菌，挑选整合成功并能够高表达的重组转化子，某种程度上与哺乳动物稳定细胞系构建原理类似。

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在毕赤酵母表达系统中，有两种基因编码乙醇氧化酶，即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为Muts。存在AOX1，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为Mut+，这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Muts和Mut+产生的原理。

GS115、KM71、SMD1168是常用的表达宿主菌，均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型，如果表达载体上带有组氨酸基因，可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷，所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时，AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的AOX1基因被强烈诱导，使目的基因大量表达。

※ 有无甲醇诱导产生的Mut+和Muts表现型

※ 酵母蛋白表达载体的选择

3) 多拷贝插入表达载体：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

※ 表达重组蛋白使其具体天然的N端

想实现表达重组蛋白使其具体天然的N端，将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点之后。Kex2蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala  *位置为Kex2蛋白酶的酶切位点。

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毕赤酵母同源重组的方式

质粒/载体和酵母表达基因图谱

图1：载体图谱：5'AOX1启动子位点   转录终止子TT，3'AOX1位点

在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的AOX1，那么重组转化子的表现型不变为Mut+，反之为Muts。

图3：重组质粒插入3’AOX1

酵母宿主菌的AOX1启动子位点被质粒/载体基因完全替代，原有的酵母AOX1启动子被破坏，表现型为Muts,取代其的是质粒/载体基因组上的PAOX，目的基因，HIS4表达序列。取代事件发生的概率较基因插入事件要小。

图4：AOX1位点被替换

※ 多拷贝插入

DFTC2023毕赤酵母专题详情  请查阅本期次条

① 毕赤酵母含有特有的AOX1强效启动子，它在甲醇中表达的AOX1基因的mRNA占细胞总mRNA的5%、AOX蛋白占细胞总蛋白的30%-40%，表达外源蛋白产量是酿酒酵母的10-100倍，并通过甲醇即可调控基因表达。

② 毕赤酵母的表达水平高，最高表达量已经突破20g/L，而CHO细胞的产量普遍在3g/L。

③ 毕赤酵母作为单细胞微生物，具有和大肠杆菌、酿酒酵母一样简单的操作。外源基因可以整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，传代过程中非常稳定、不易丢失。

④ 毕赤酵母的发酵工艺成熟，易放大。目前已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上，表达重组蛋白已成功放大到80,000L。

⑤ 毕赤酵母发酵使用的培养基成本低廉，碳源为甘油或葡萄糖，其余为甲醇、氨水或硝酸盐等氮源以及少量无机盐，培养基中不含蛋白，可以简化外源蛋白的下游纯化过程。

⑥ 毕赤酵母分泌效率较高，对于带有指导分泌信号肽序列的外源目的基因，毕赤酵母可以直接将目的蛋白分泌到发酵液中，有利于后续分离纯化。

② 目的基因的优化

目的基因决定表达成败的首要因素。由于密码子的简并性，不同的表达系统都有其特定的偏爱密码子。所以在基因合成时便要进行密码子的优化，换掉稀有密码子并进行mRNA结构优化，提高蛋白表达量，防止蛋白不表达或表达量低。

③ 影响蛋白分泌的因素