发酵菌种：主菌库MB和工作库WB的构建

微生物的菌种包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。

01

菌种筛选

工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛，挑选具有某种能力的有用菌种。

菌种分离首先是从土壤或腐生植物中收集含菌样品，用无菌水稀释后，涂布于置有适宜细菌、放线菌或霉菌生长的琼脂培养基平皿上，并将其倒置于恒温箱中，培养一定时间，平皿上长出的许多单个菌落（单一微生物的集落）经分别分离后即为各种纯种菌株,简称纯种,移种至试管斜面上，置4℃冰箱备用。

根据不同的筛选目的，采用不同的筛选模型。如常规筛选抗生素产生菌的方法是将土壤中分离所得的纯种，在含有琼脂培养基的平皿上培养后，用打孔器将菌块移至含有试验菌的琼脂培养基上，在适宜的温度下培养一定时间后取出，如在菌块的周围有透明的抑菌圈，则表明此菌种具有产生抑制试验菌生长的抗菌物质的能力。所得菌种经过摇瓶液体发酵，测定发酵液或菌丝体内抗生素的含量，选出生产能力高的菌种。另一方面对所提取的抗生素进行结构分析、药理试验及临床试验等，确为有效者，即可作为生产菌种。又如筛选脂肪酶生产菌种的方法是将分离所得的霉菌涂布于含有牛脂的琼脂培养基上，恒温培养一定时间，如菌落周围出现透明圈的，则该菌具有分解脂肪的能力，进一步作摇瓶发酵测定酶活力，挑选产量高者作生产菌种的出发菌株。

02

菌种改良

 即采用遗传育种的方法，使野生型菌株(从自然界分离筛选而得的出发菌株)的遗传因子 DNA发生突变、重组，从而从中选出产量高、成品质量好或具有新的培养特性如耐产物抑制、能利用廉价原料以及具有生产新品种能力的优良菌种。采用的方法有诱变育种、杂交育种、和。诱变育种是利用诱变因子如紫外线、钴－60、乙烯亚胺类等物理或化学诱变剂处理生产菌株的单孢子悬浮液，以获得诱发突变株。随后进行突变株的筛选，从中筛选高产菌株。由于随机的突变群体中，有益突变所占比例很低，要获得高产突变株必须进行大量筛选。近年来，随着发酵代谢控制研究的发展,可根据生物合成途径中的反应点,并通过它们的改变以提高产率或其他特性，如选育抗产物反馈抑制的突变株、增加细胞透性的突变株及营养缺陷型的突变株等。这种“理性筛选法”广泛应用于氨基酸产生菌的选育。

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03

菌种制备

也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见图[菌种制备流程]菌种制备流程），其中(1)～(4)为孢子制备过程。

保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天(或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10％以下，并放入 4℃冰箱中备用。

 一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。放线菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中,于28～37℃培养5～14天。

 所获得的大量孢子可直接作为种子罐的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆等）,及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体接种量一般在10％～20％。