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新蛋白食品饮料论坛视频第三十一期：APAC Society for Cellular Agriculture

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发酵工艺：蛋白类制品的大规模发酵制备及其一般纯化工艺

来源：世展网分类：生物行业资讯 2023-04-10 15:39 阅读：9686

2026年慕尼黑上海国际分析生化及实验室展览会Analytica China

2026-11-16-11-18

距离689天

1 蛋白发酵大规模制备分为普通蛋白发酵和高密度发酵，包括蛋白发酵过程优化，温度、pH、溶氧、补料方式等方面。补料分批策略是高密度发酵实现高收益的最有效方法。补料分批策略是蛋白高密度发酵实现高收益重组蛋白的最有效手段。通过调节培养条件，包括温度和酸碱值、培养物及底物的进料速率，能够最大限度地提高细胞质量和生产率。

2 补料分批策略1)定量补料—恒定的速率分批补料，结果是，有效的增长速率降低；2)循序补料—循序渐进、逐步的进行补料，结果是进行一定的营养补偿，缓解因物质消耗而下降的生产速率；3)指数流加补料—补料的方式采用指数的速度进行，从而实现恒定的比生长速率；

2.2 间接反馈控制

1、溶氧—随着底物的消耗，溶氧量增加进行补料，增加氧气；2、pH—随着反应的进行，底物被消耗，代谢物积累，pH增加，可进行补料；3、二氧化碳释放率（CEO）—蛋白发酵实验中维持特定生长速率的最常用方法。通过质谱仪检测，碳源的利用率和二氧化碳的消耗率大致成正比；4、细胞培养浓度—通过激光浊度计测得细胞浓度，补料的速度由细胞培养浓度决定。

2.3 直接反馈控制

控制底物浓度—补料由发酵过程中碳源的浓度决定。（例如在发酵罐有实时的葡萄糖分析仪监测）大肠杆菌菌株高密度发酵研究，通过在600nm处测得细胞的OD值。

3 蛋白纯化方法

蛋白纯化策略侧重于在提高蛋白纯度的同时减少蛋白表达量的损失。因此我们常采用多种纯化方式混合纯化的方法，常用的纯化方法有以下四种：

3.1 亲和纯化

利用目的蛋白与其特异性配体之间的亲和力分离蛋白；固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签（His-Tag）在原核蛋白表达中的应用最为显著。

3.2 离子交换色谱法

将离子交换剂与目的蛋白的电荷结合，通过改变PH或增加离子强度的缓冲液洗脱目的蛋白；离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。

离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架构成，骨架上有许多共价结合的带电基团，如果侧链是带正电基团，就可与带负离子相结合，称为阴离子交换剂，吸附带负电蛋白质。如果侧链是带负电的基团，则称为阳离子交换剂。强离子交换树脂在宽pH范围内保持离子化，而弱离子交换树脂只在窄pH值内离子化。

3.3 凝胶过滤色谱法

主要依据蛋白质分子量和分子形状进行分离。凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。

通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。

3.4 疏水色谱法

疏水色谱法是采用具有适度疏水性的填料，以含盐水溶液作流动相，借助于溶质与固定相间的疏水相互作用实现分离纯化的方法。

疏水相互作用是蛋白质折叠的主要驱动力。疏水基团彼此靠近聚集以避开水的现象称为疏水相互作用(hydrophobic interaction)。当蛋白质中的疏水侧链聚集蛋白质内部，而不是被水溶剂化时，蛋白质在水中是很稳定的。疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互作用要比水与其他非极性分子的作用更强烈。非极性侧链为避开水而聚集到蛋白质分子内部。与之同时，大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。分子内部的疏水特性不仅解释了疏水残基的聚集，而且也说明了螺旋和折叠片的稳定。

3.5 高效液相色谱法

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。